代谢组学：未来新方向（What's next in 'omics: The metabolome）

　　加拿大阿伯特大学生命科学与计算科学教授David Wishart说，我们自身其实就是一大组生化反应，“因此，基因组和蛋白质组不断进化来支持代谢组，而不是相反的路径。” Wishart说，有别于其他组学方法，代谢组学提供了一种更加直接的生理状态检测方式。代谢组反应营养、胁迫或者疾病状态的速度比转录组或者蛋白质组要快得多。这使得代谢组在许多领域都非常吃香，如环境毒理学、进化和发育、疾病诊断与治疗反馈、以及药物、杀虫剂和除草剂的研发等。代谢组流动检测帮助合成生物学家揭示遗传改变如何影响通路和产物。

　　作为组学家族最年轻的成员，代谢组学发展势头正劲。2014年，国际代谢组学学会主办了他们的第10次年会，与首次会议是同一座城市：日本鹤岗市。“第一年，我们有大约150人参会。”墨尔本大学助理教授、该校的澳大利亚代谢组分站负责人Ute Roessner说，“今年我们有超过500名注册参会人。而且代谢组学已经成为了每位研究者研究工具的一部分。现在，年轻的研究者定期开展代谢组学工作，作为他们博士工作的一部分。”

　　代谢组学最主要的挑战根植于它的优点。代谢组数据很强大，因为生物体具有许多的代谢物，包括相关的前体、衍生物和具有一定浓度的降解产物，它们都极具多样性且变化迅速。这种复杂性需要精妙的分离和检测方法。代谢组学包括了脂类分析，这是一个极具潜力的发展领域，赛默飞世尔科技公司策略市场部经理黄盈盈(音译)说：“脂质组学与心血管疾病、癌症、糖尿病和肥胖症直接相关。然而脂质在体内的结构和浓度极具多样性，能达到10倍的变异。”许多生理脂类和其他代谢物共享一种化学组成，仅仅在排列上具有差别。因此，加州大学戴维斯分校教授、西海岸代谢组学中心主任Oliver Fiehn将代谢组学称为“异构体科学”。

　　仪器的决策树

　　人们对代谢组学的兴趣不断增长，促使分子分离和检测仪器的制造商研发出各种针对代谢组学的硬件、软件和技术支撑。当研究人员需要将这些技术带进实验室时，他们面临着复杂的决策树。第一个分支就是非靶向还是靶向的分析。非靶向方法在所有可能的组分上聚集数据。靶向分析则聚焦于已知的组分，经常是数量上的变化，例如在胁迫和疾病的反应过程中。

　　核磁共振光谱学(NMR)对于靶向分析来说尤为强大，因为它可定量、可重复，适合于检测复杂样品如血液、尿液或仅需少量或不经过处理的少量组织提取物。芬兰奥卢大学分子流行病学负责人Peter Würtz最近作为共同作者发表了一篇文章，该项工作利用布鲁克公司的仪器，将NMR代谢组学应用于数千个爱沙尼亚和芬兰的生物银行样品中。研究团队找到了四种生物标记，当组合在一起时，与各种情况的猝死风险的提高显著相关。Würtz指出，这一研究是观测性的，并没有探究其机制，但却展示了NMR在生物标记分析中的能力。然而，使用NMR的代谢组学分析也存在局限，因为它的灵敏性比更加流行的代谢组学方法“质谱分析法(MS)”要低好几个数量级。

　　质谱需要样品处理。组分通常需要离子化并经过分离，最常用的方法是气相色谱(GC)和液相色谱(LC)法。毛细管电泳(CE)能很好地分离极性代谢物，能够用到与单细胞一般大小的样品中。毛细管电泳—质谱联用是人类代谢组技术公司(HMT)的特色产品，而像安捷伦和爱博才思等企业也提供该产品。但是，毛细管电泳技术需要专业的操作者和强大的软件来分析迁移时间中的漂动，安捷伦代谢组项目经理Theodore Sana说。

　　毛细管电泳—质谱联用技术的强大之处在于解析那些易于挥发或者能够通过衍生物挥发出来的物质，例如原初中心代谢的小分子。而液质联用技术则特别适用于大的、热不稳定的有机分子，包括许多次生代谢产物、较大的碳水化合物和脂类。一些诸如超高效液相色谱(UPLC，最初由Waters公司研发)、超临界流体色谱和离子迁移分离法的新进展，提高了速度和分离能力，囊括了非极性分子和具有多种异构体或异位体的组分(例如脂类)。分离方法与质谱分析器偶联起来，例如飞行时间(TOF)质量分析器，能够快速、高分辨率地解析大质量范围的分子。加入四级或线性离子捕获器可以选择在离子化过程中产生的特定成分或组分片段。一旦研究者完成了代谢组特性的分类，他们就可以决定是购买仪器还是将样品送往服务机构。

　　供应和服务商的选择

　　安捷伦提供有气质联用、液质联用、毛细管质谱联用和NMR等仪器。Sana 说：“作为单个供应商能提供所有这些技术，包括了硬件、软件和技术支持，我们具有不可替代的位置。”(岛津公司也提供被研究人员推荐为廉价的原初装置的多种系统。)用户对安捷伦提供的直观软件给予了好评，Sana证实这确实是公司优先考虑的事情。举例来说，安捷伦的GeneSpring —质模专业版软件用于多重组学数据的整合分析。Sana 说，“GeneSpring可以使你采用来源于RNA、蛋白质和代谢物完全不同的数据，并将它们动态地映射在生物通路上，就像KEGG(一种代谢通路工具)那样。” GeneSpring也支持预处理来自其他厂商平台的数据，例如作为一个电子表格。使用一个通路工具对来源于大量实验的结果进行可视化，这对于搜集生物学洞察力、计划接下来的实验来说十分有用，Sana说。

　　爱博才思专注于液质联用质谱仪，研究人员高度评价了该仪器快速的数据获取，卓越的动态范围，以及定量化和准确的质量能力(通常定义为百万分之五或更低的精度)。该公司也提供毛细管电泳和离子迁移的选择。对于代谢组学来说，爱博才思推荐三联TOF和QTrap系统。公司高级市场经理Fadi Abdi说，“我们的三联TOF是进行定性定量分析的高分辨率、精确质谱仪，适合于代谢组学的发展。Qtrap是为要求灵敏性、靶向性和定量性的工作流程所设计的。”Abdi这样解释，为了鉴定、确认和定量产物，三联TOF系列的高获取速度可以在一个液相时间段的单次进样中同时完成质谱和串联质谱分析。Qtrap的多重反应检测器提供父本化合物的数据和由质谱随后产生的片段，简化数据处理流程并使研究者对他们的数据具有信心，爱博才思代谢组和脂质组学应用部门研究员Baljit Ubhi说。

　　那些寻找广泛代谢物覆盖的研究者可以考虑爱博才思的组合包，融入了爱博才思的高分辨率液质联用系统和力可公司的高分辨率气质联用系统。这一合作为客户提供了“两种技术的精华”，力可市场技术部主任 Jeff Patrick说。组合包中包括了来源于Genedata公司的软件，能够将来源于两个平台的数据整合以提供可靠的代谢组学分析。

　　另一种流行的多功能液质联用质谱选择是赛默飞世尔科技公司基于轨道阱(Orbitrap)技术的仪器。轨道阱质谱分析仪通常用于蛋白质组，但是在整合了一个高级分离系统(如UPLC)时，它的高分辨率能力尤其适用于代谢组学的分析，黄盈盈说。平行检测消除了为了加速样品分析所需的多重运行。赛默飞世尔科技公司产品线上的最新系统是具有三个质谱分析仪的轨道阱融合三杂交系统。液相分离以后，通过四极孔样品过滤，并在随后的轨道阱和线性离子捕获中进行可能的平行分析。黄盈盈说，三杂交系统的设计初衷是为研究人员提供灵活性与精确的质谱性能。

　　赛默飞世尔科技、爱博才思和布鲁克也提供质谱成像的仪器，这也被称为MALDI成像法。Roessner解释，这种方法克服了代谢组学的一个局限：代谢物分析通常只能在均一化的样品或提取物中进行，但是那些特定的细胞和组织却具有不同的代谢物特征。质谱成像技术为一个纤薄的组织切片(例如，来源于一个器官或植物组织中)提供了代谢物空间分布的图像。这一过程是使用激光解吸将矩阵处理的样品进行组分离子化，然后再使用质谱进行分析。对组分进行二维图像的重建提供了组织间代谢物的定位。

　　Roessner在该项技术中使用了布鲁克系统，他说：“尽管仍在初级阶段，但这是一种令人兴奋的方法。它可以用于观察肺部样品中药物相关代谢物的分布，或者去追踪环境刺激后，组织中代谢物分布的改变。”赛默飞世尔科技的轨道阱系统在此方法上具有优势，黄盈盈说：“因为离子是来源于组织的，没有经过液相分离，你需要一种超高分辨率的仪器，就像轨道阱。”

　　对于不打算购买系统或者倾向于服务所带来的便捷性的研究者来说，他们也有很多选择。Biocrates公司和Metabolon公司都面向全球提供质谱代谢组学分析服务。Metabolon公司也涉猎大型、长期的合作，例如Craig Venter的人类寿命项目，Metabolon 公司销售市场高级副总裁Chris Bernard说，在代谢组学如何付诸实践、如何用于一系列项目中的问题上，合作对于Metabolon公司而言很重要。

　　NMR代谢组学所具备的优势在于不通过标准曲线的真正定量，样品可保留，可实现最少样品的操作，单次反应就能检测到所有带有结构信息的代谢物。但是科学家对于它的兴趣可能会受到装机成本的阻碍。研究人员可以通过服务商来获取这种方法，例如Chenomx公司。Würtz和他的同事也通过Brainshake公司提供NMR代谢组学的服务与合作。这是建立在他们使用NMR进行生物标记研究的经验，并将代谢组学数据与全基因组关联研究联系起来，该研究将遗传变异和疾病风险联系在一起。

　　代谢组学服务机构正在通过国家和学术中心设施快速增长。在澳大利亚，Roessner属于第一批建立政府资助的国家代谢组服务平台。加拿大也资助国家代谢组的项目，其他国家也在这个领域跟进。在美国，国立卫生研究院(NIH)共同基金早在2012年就开始建立代谢组学的区域中心。负责西海岸项目的Fiehn说：“这些中心提高了代谢组学的能力，能够为学术界和产业界服务，而且他们有不同的特色，例如肯塔基中心的代谢流平台和北卡罗来纳的核磁共振平台。”国立卫生研究院的中心平台也为初次接触代谢组学的科学家提供短期课程。

　　下一步挑战

　　当被问到代谢组学面临的重大挑战时，研究人员和供应商一致认为有三点：对未知物的鉴定;研发出可供查询的标准数据集，就像GenBank的基因组资源;代谢组学与其他全系统数据的整合。

　　“质谱太过于敏感，因此我们得到了大量物质，却不知道它们是什么。”Wishart说。为了帮助研究者进行代谢物鉴定，安捷伦研发了气质和液质联用质谱的数据库，专供基于质谱技术的代谢物鉴定。力可公司提供了一个GC-TOF的数据库，据Patrick表示可用于任何气相色谱的数据，尽管该数据库是为力可公司的仪器而进行的优化。力可公司目前正在探索与高分辨率精确质谱库进行合作的机会。

　　Wishart意识到，最未知的是代谢物中的代谢物：“分解产物和由酶转换而来的或者具有微生物活性的分子。”这种分子的相似性是鉴定它们的关键因素。Fiehn团队研发了一些商业化的质谱文库，也在开发虚拟文库。研究人员可以从物质已知的谱图数据出发，来预测相似的或修饰变异物的谱图。LipidBlast是Fiehn团队开发的串联质谱虚拟谱库，超过20万种脂类可供免费下载。

　　为了面对数据整合和可搜索性所带来的挑战，代谢组界采取了一些举措，推动数据存储库的建立。例如位于英国的Metabolights是由欧洲代谢组学标准协调委员会(COSMOS)联盟所支持的，该联盟制定了代谢组学的数据标准。还有代谢组学工作平台(Metabolomics Workbench)，该平台旨在建立国立卫生研究院资助下的代谢组项目的数据库。赛默飞世尔科技与Fiehn合作推出了mzcloud.org网站提供免费的社区数据库，数据库包括在鉴定时有待注释的未知组分的真实和虚拟谱图。

　　即便是在代谢组学界有了存储数据的数据库之后，Patrick仍意识到，鉴于大量数据的背景和意义，“系统生物学的首要挑战是生物学干扰”。他认为解决的方案是软件，这“驱动着代谢组学的发展方向。” Bernard也有同感，他表示Metabolon公司客户首要的需求是帮助他们理解结果的生物学意义，“质谱对于产生数据来说很不错，挑战在于从噪音中分离出信号：85%的质谱数据点都是噪音”。Metabolon公司的客户可以使用MetaboLync的门户网站，其中包含了他们样品中的一系列代谢物，对比拥有超过1.4万种组分的本地文库，用于自动认证代谢物的鉴定，Bernard补充道，另外该门户最强大的特性在于，它具有在通路水平可视化并探索数据的能力。

　　随着该领域的不断发展，仪器供应商和服务提供商都迫切地期待与用户在他们的代谢组学研究上展开合作和讨论，不仅是买卖关系，而且可以掌握当前动态。“我们正与一些科研人员开展密切合作。”Sana 说，“在推进代谢组学领域的发展中，研究人员往往是新点子的来源。”

　　(译者之一高大海系中国科学院海洋研究所助理研究员)

　　Chris Tachibana 是美国西雅图和丹麦哥本哈根的科学作家。

　　原文：What's next in 'omics: The metabolome